INTRODUCCION.

Gran parte de los progresos alcanzados por la biología moderna se deben al perfeccionamiento de los métodos analíticos de medida. La introducción de los procedimientos basados en las reacciones inmunológicas ha representado un importante avance en el análisis de sustancias de interés en biología animal y vegetal difíciles de medir empleando los métodos bioquímicos habituales.

Dentro de los procedimientos inmunológicos, los más útiles y prácticos son aquellos que se basan en la especificidad de la unión Ag-Ac. La propiedad que tienen las Igs de unirse a un Ag, la especificidad de esta unión y el hecho de que pueda ser visualizable por los fenómenos de precipitación, aglutinación y otros mecanismos indirectos (marcaje con fluoresceína, con radioisótopos o con enzimas) hacen que estos métodos se empleen ampliamente.

Existen diversos métodos basados en procedimientos distintos para visualizar la unión Ag-Ac (Tabla 17.1). Así tenemos: 

1.   Técnicas de aglutinación. Cuando el antígenos e encuentra unido o formando parte de células, bacterias o partículas, la reacción Ag-Ac se puede detectar y cuantificar por el aglutinado celular o bacteriano formado.

2.   Técnicas de fluorescencia y citometría de flujo. Para la realización de estas técnicas el anticuerpo se marca con un fluorocromo detectándose la formación del complejo Ag-Ac por la fluorescencia emitida.

3.   Técnicas de radioinmunoensayo. En estas técnicas al anticuerpo se une un isótopo radiactivo siendo posible la cuantificación del complejo Ag-Ac a través de la radiactividad emitida.

4.  Cromatografía de afinidad. La especificidad de la unión Ag-Ac puede utilizarse para obtener Acs y Ags puros.

5.  Inmunoprecipitación e inmunoblotting. Permite detectar la presencia y cantidad de antígenos y anticuerpos específicos. 

TECNICAS DE  PRECIPITACION    

Para la realización de estas técnicas se requiere que tanto el Ac como el Ag se encuentren en un medio fluido en el que sea posible la precipitación del complejo Ag-Ac. Existen diferentes modalidades siendo las principales:

1. Técnica de precipitación propiamente dicha.

2. Técnica de difusión radial de Ouchterlony.

3. Técnica de inmunoelectroforesis.

4. Técnica de difusión radial simple de Mancini. 

Técnica de precipitación 

El complejo Ag-Ac precipita espontáneamente o por centrifugación cuando la proporción de Ags y Acs de la mezcla es equivalente. En la Figura 17.1 se muestra un esquema de los tipos de complejos formados al mezclar, en tubos de ensayo, soluciones con diferentes cantidades de antígenos a los que se añaden igual cantidad de un anti­suero. La precipitación es máxima allí donde la proporción entre ambos es óptima (parte central de la curva), pero va disminuyendo a medida que predomine el Ac o el Ag (izquierda y derecha de la curva respectivamente) Este tipo de reacción no es muy utilizado al requerirse grandes concentraciones de antígeno y de anticuerpo para poder medir el precipitado formado.

Técnica de difusión radial doble de Ouchterlony

Esta técnica se realiza en placas de agar en donde se practican pocillos (Figura 17.2). En uno de estos pozos se coloca el suero o muestras a investigar y en el resto se coloca el anticuerpo preparado frente a la sustancia que se quiere identificar. Cuando difunden, ambos sistemas se encontrarán y se formará en la zona de equivalencia el complejo Ag-Ac correspon­diente que se hace visible en forma de una línea de precipitación. En una preparación que contenga varios antígenos, se obtendrán múltiples líneas de precipitado. 

La técnica de Ouchterlony permite identificar sustancias según la forma de unirse las líneas de precipitación de dos o varios sistemas.  

Técnica de inmunoelectroforesis

La inmunoelectroforesis es una técnica que se realiza en dos fases. Primero se separa la mezcla de Ags por electroforesis y posteriormente el antígeno que se desea detectar se hace reaccionar con un anticuerpo específico colocado en un pocillo lateral. Por difusión llegan a encontrarse los antígenos y el antisuero, apareciendo el complejo Ag-Ac visible en forma de líneas de precipitación que pueden ser estudiadas por comparación con un sistema estándar (Figura 17.3). En Inmunología clínica, esta técnica puede utilizarse en la identificación de las proteínas de mieloma.

Técnica de difusión radial simple de Mancini

Esta técnica se basa en la difusión de un antígeno colocado en un pocillo en un gel de agarosa que lleva incorporado un anticuerpo específico. Este anillo de precipitación es fácilmente visible y las concentraciones ant­génicas están en relación directa con el área del círculo de precipitación. Al difundir el antígeno se genera un gradiente de concentración desde el pocillo donde se ha colocado. Cuando la concentración del antígeno es la adecuada (zona de equivalencia) el inmunocomplejo se insolubiliza y se forma un anillo de precipitación (Figura 17.4).

TECNICAS DE AGLUTINACION    

En estas técnicas se hacen visibles los complejos Ag-Ac por la aglutinación que producen los anticuerpos cuando el Ag forma parte o se ha unido artificialmente a la superficie de glóbulos rojos, plaquetas, leucocitos, partículas de látex, etc. Normalmente se utilizan glóbulos rojos (hemaglutinación) o partículas de látex. 

Hemaglutinación directa

La presencia de antígenos en la superficie de los glóbulos rojos se puede detectar por la hemaglutinación producida cuando se añade un antisuero con anticuerpos frente a dichos antígenos.

Esta técnica se emplea habitualmente para la identificación de los grupos sanguíneos y Rh, para lo cual a la sangre heparinizada se le añaden los antisueros correspondientes: anti- A, anti-B o anti-AB (todos ellos anti-Rh negativos). Habrá aglutinación cuando los glóbulos rojos posean la especificidad del antisuero añadido (Tabla 17.2). De igual manera se procede con antisueros anti-Rh para la determinación de los distintos grupos Rh.

Hemaglutinación indirecta

 Se basa en el principio de la inhibición de la hemaglutinación. Para su realización se precisan glóbulos rojos a los cuales se les ha unido la misma sustancia que se desea detectar o cuantificar (Figura 17.5). Si estos glóbulos rojos son puestos en presencia de anticuerpos preparados frente a dicha sustancia se producirá su aglutinación. Por el contrario, cuando se añade un suero problema que contiene la sustancia a cuantificar entonces los anticuerpos se unirán a dicha sustancia y no a los glóbulos rojos. En este caso no se producirá la hemaglutinación. Por tanto, aglutinación (+) indica ausencia de la sustancia a estudiar, y aglutinación (-) indica presencia de la misma. La medida de gonadotrofina coriónica (HCG) para el diagnóstico de embarazo puede realizarse por esta técnica.

 TECNICAS DE INMUNOFLUORESCENCIA

La fluorescencia es una propiedad de ciertas moléculas que, al ser irradiadas con energía electromagnética de longitud de onda adecuada, emiten radiación de longitud de onda característica permitiendo su cuantificación.

Las moléculas de un colorante fluorescente absorben luz en una longitud de onda y convierten la luz absorbida de alta energía (longitud de onda más corta) en luz de menor energía (longitud de onda más larga). Cada fluorocromo tiene un espectro de emisión y excitación característicos; si se utilizan dos con el mismo espectro de excitación pero distinto espectro de emisión, se pueden medir dos características al mismo tiempo (fluorescencia de dos colores).

La inmunofluorescencia se utiliza esencialmente en la detección de autoanticuerpos y anticuerpos contra antígenos de superficie de células y tejidos. Para ello se emplean anticuerpos preparados frente a la proteína que se desea detectar marcados con moléculas fluorescentes (Figura 17.6). Se aprecia si hubo unión del anticuerpo con el antígeno por la fluorescencia emitida, que se observa bajo microscopio de luz ultravioleta. Este procedimiento (Inmunofluorescencia directa) tiene la limitación del marcaje con un fluorocromo de cada uno de los anticuerpos necesarios para cada una de las sustancias a investigar. Para evitar esto, lo que se hace es tratar el tejido o células con antisueros anti-antígeno producidos, por ejemplo, en conejo y secundariamente anti-inmunoglobulinas marcadas con un fluorocromo (Inmunofluorescencia indirecta)

CITOMETRIA DE FLUJO

La técnica de inmunofluorescencia se suele utilizar en el estudio de poblaciones de células de sangre periférica. Actualmente el análisis de una suspensión de células vivas marcadas con un fluorocromo se realiza mediante un citómetro de flujo. La suspensión celular  se hace circular en forma de gotas microscópicas. Las células pasan por un campo de detección atravesado por un potente rayo láser que produce la dispersión de la luz y la activación de la fluorescencia. Mediante sensores específicos  se analizan y cuantifican las poblaciones en estudio en función de sus propiedades fisicoquímicas y del marcaje efectuado. Para la separación celular este aparato lleva acoplado un sistema que carga eléctricamente las células y con placas deflectoras se realiza su separación  (Figura 17.7). Además de basarse en la detección de la fluorescencia emitida por las células marcadas, tambien lo hace en otras propiedades diferenciales de las células en estudio como tamaño (FSC), complejidad (SSC), etc. (Figura 17.8).

La señal producida como consecuencia de la excitación del fluorocromo, permite conocer el porcentaje de células reconocido por el anticuerpo monoclonal empleado. Como consecuencia se observan imagenes en dos dimensiones (Dot-Plot) (Figura 17.9).o en una dimensión (Histograma) (Figura 17.10) en las que se distinguen las diferentes poblaciones celulares marcadas.

La puesta a punto de las técnicas de citofluorometría, en las que se conjugan los avances de informática, rayos láser y anticuerpos monoclonales permite el análisis fenotípico y funcional de las células T, B y de todas aquellas células de las que se disponga de un antisuero que las identifique. En la tabla 17.3 se recogen los valores normales obtenidos en células de sangre periférica.

Marcadores de linfocitos B. Para cuantificar los linfocitos B totales se utiliza el marcador CD19. Por otro lado, en los linfocitos B activados se pierde la expresión de las moléculas CD21, CD22 y CD24, hay un incremento en la expresión de moléculas HLA-DR y de receptores de linfocinas (por ejemplo el receptor de la IL-2) y aparecen marcadores nuevos, como el CD23, ausente en linfocitos B en reposo.

Marcadores de linfocitos T. En este caso se utilizan los marcadores CD3, CD4 y CD8 presentes de forma específica en linfocitos T totales y en la subpoblaciones de células T de colaboración y citotóxicas/supresoras respectivamente. En el proceso de activación celular T se expresan nuevas moléculas de superficie, son principalmente receptores para factores de crecimiento y proliferación celular. Entre estos nuevos antígenos de activación expresados en la superficie celular se incluyen: a) receptores de interleucinas (como la molécula CD25 que corresponde a la cadena p55 del receptor de la IL-2); b) receptores de la insulina y de la transferrina (CD71); c) antígenos del Complejo Mayor de Histocompatibilidad (CMH) clase II, que no están presentes en linfocitos T en reposo; y d) una gran variedad de moléculas de superficie, cuya función no es totalmente conocida (por ejemplo, CD26, CD29, VLA-2, CD69).

 En donde:  Ac: Anticuerpo; Ag: Antígeno (sustancia a cuantificar); Ag*: Antígeno marcado con un isótopo; Ag-Ac: Complejos de anticuerpos y antígenos no marcados y  Ag*-Ac: Complejos de anticuerpos y antígenos marcados

 TECNICA DE RADIOINMUNOENSAYO   

El radioinmunoensayo (RIA) se basa en la competencia que se establece, para unirse a anticuerpos específicos, entre la sustancia a cuantificar y cantidades conocidas de la misma sustancia marcada con un isótopo. Al establecerse esta competición resulta que a mayor cantidad de sustancia a cuantificar, menor será la cantidad de sustancia radiactiva que se une al anticuerpo y viceversa  (ver esquema anexo).

Este tipo de reacción se encuentra esquematizado en la Figura 17.11. Los resultados se obtienen al medir la radiactividad de la hormona marcada unida al anticuerpo y la de la hormona marcada libre mediante un contador de centelleo. Al centrifugar, la hormona libre queda en solución y la hormona unida al anticuerpo forma agregados fácilmente precipitables. Una vez medida la radiactividad se construye una curva con los resultados obtenidos con cantidades conocidas de hormona sin marcar y marcada. A esta curva se llevan los valores obtenidos de los sueros problema y se obtiene la concentración de la hormona no marcada a investigar.

En el RIA directo, a la fase sólida se une una cantidad conocida de Ac. Diferentes concentraciones conocidas de antígeno marcado se incuban con una concentración constante de la muestra de la que se desea conocer la concentración del antígeno en cuestión. El fundamento y la detección no sufrirían cambios respecto lo anteriormente comentado. El RIA de inhibición también sería una técnica competitiva de análisis pero lo que se une  a la fase sólida es una cantidad fija de antígeno. Para el proceso de inhibición se incuba una concentración fija de anticuerpo marcado frente a una serie de diluciones de la muestra que contiene el antígeno. Existe una técnica no competitiva que es la denominada sandwich: Se une un Ac en cantidades constantes a la fase sólida. Una vez realizado el bloqueo, se añade el antígeno en concentraciones variables. Posteriormente se añade un segundo anticuerpo contra el antígeno, pero esta vez marcado.  Además del radioinmunoensayo antes descrito hemos de considerar que, en la actualidad, es cada vez más frecuente el empleo de inmunoglobulinas marcadas con isótopos radiactivos para su posterior aplicación en diferentes campos: trazador en determinaciones in vitro de antígenos específicos, en técnicas inmunorradiohistológicas y técnicas de análisis no competitivo que pueden ser una alternativa al RIA en la determinación de algunas moléculas que no pueden ser marcadas directamente con radioyodo, en la detección de tumores primarios o metastásicos (inmunoescintografía) e incluso la posibilidad de irradiación local de células neoplásicas (inmunorradioterapia).

Todas las posibilidades anteriormente indicadas se basan en la posibilidad de marcar el anticuerpo con radioyodo sin mermar su inmunorreactividad. El marcaje de proteínas o péptidos con yodo radiactivo I¹²⁵ ó I¹³² puede realizarse por diferentes métodos. La incorporación del yodo a la molécula se realiza en los aminoácidos aromáticos que forman parte de la estructura de la cadena peptídica: tiroxina, fenilalanina, triptófano o histidina.

La técnica del radioinmunoensayo posee algunos inconvenientes que derivan de la necesidad de utilizar isótopos. Además de su peligrosidad y la obligatoriedad de disponer de instalaciones adecuadas para su utilización, existen isótopos que tienen el inconveniente de su pronta caducidad.  

TECNICA DE ENZIMOINMUNOENSAYO.  

Esta técnica, también se conoce como test de ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay). La identificación de los complejos Ag-Ac, se hace mediante el empleo de enzimas, bien unidas al antígeno, o bien unidas al anticuerpo. El test de ELISA puede ser directo o no competitivo, constando de los siguientes pasos: a) Se tapiza la placa con el anticuerpo específico frente al antígeno a determinar. b) Se añade la muestra con el antígeno. c) Se adiciona el anticuerpo secundario marcado con la enzima que en presencia de su sustrato da un producto coloreado soluble, este producto es cuantificado mediante el lector de ELISA (Figura 17.12) e indirecto o competitivo,  se diferencia del caso anterior en que se añaden los anticuerpos, previamente incubados con la muestra, los anticuerpos que no se han unido a los antígenos de la muestra lo harán a los antígenos de los pocillos (Figura 17.13) Como enzimas se suelen utilizar la peroxidasa, la galactosidasa o la glucosa oxidasa.

Esta técnica se utiliza para la medida de hormonas, antígenos de la hepatitis  y otras muchas sustancias que se encuentran a muy bajas concentraciones.

Una variante de esta técnica de gran utilidad se conoce como test en fase sólida y está orientada a la determinación de anticuerpos frente a un determinado antígeno. Para ello el antígeno se encuentra fijo a un soporte (por ejemplo tubo de plástico). Al añadir la muestra con el posible anticuerpo se unirá y podrá ser detectado añadiendo anti-inmunoglobulinas marcadas con el enzima.

Otra variante de las aplicaciones inmunoenzimáticas es cuando el antígeno se encuentra fijo en células o tejidos. Al igual que hemos visto en el apartado de inmunofluorescencia indirecta, en este caso también se emplean dos anticuerpos. El primero, con actividad frente a los antígenos a estudiar, y el segundo, que va dirigido frente al primero y que actúa de puente con el complejo portador de la enzima. Cuando la enzima es la peroxidasa, este complejo suele ser una peroxidasa-antiperoxidasa (PAP) (Figura 17.14).

La diferencia principal entre las técnicas de RIA y ELISA es que la primera utiliza como marcador un isótopo y la segunda la actividad de un enzima, así el RIA directo y el ELISA competitivo serían equivalentes, y también existiría ELISA de inhibición y ELISA en Sandwich. Existen inmunoensayos que se denominan homogéneos en los cuales no es necesario la separación de los inmunocomplejos de los reactivos libres. Son técnicas muchas de ellas patentadas por diferentes firmas comerciales.

TECNICAS NEFELOMETRICAS     

Estas técnicas se basan en la detección de los complejos Ag-Ac, por la refracción que dichos complejos producen sobre rayos de luz que se hacen pasar por el tubo con el antígeno y el anticuerpo correspondiente. Habitualmente se utilizan rayos láser y se establece una relación entre la cantidad de luz que llega y la cantidad de complejos formados (Figura 17.15). Este procedimiento es rápido y sensible y se está utilizando en la actualidad, sobre todo, para la cuantificación de proteínas en suero y en otros líquidos biológicos.

SELECCION DE CELULAS UNIDAS A UN ANTICUERPO

En la actualidad disponemos de varios métodos para seleccionar células a las que previamente se ha unido un anticuerpo. La adición de complemento elimina dicha población celular (selección negativa), es la denominada técnica de inmunotoxicidad.

La separación inmunomagnética se basa en la interacción entre antígenos celulares superficiales y anticuerpos unidos a bolas magnéticas (Figura 17.16). La aplicación de un campo magnético permite separar las células unidas a las bolas (selección positiva) de las células no unidas (selección negativa). Es un método fácil, rápido y no muy costoso. Este método presenta muchas aplicaciones no sólo en Inmunología sino también en Microbiología, utilizando bolas unidas a anticuerpos frente a un determinado microorganismo; en Biología Molecular para aislamiento de DNA y mRNA utilizando bolas a las que se adsorbe el DNA y bolas unidas a una secuencia de oligonucleótidos respectivamente. También se pueden usar para la purificación de proteínas si se unen las bolas a anticuerpos específicos.

La separación de células puede realizarse mediante el FACS (Fluorescence activated cell sorting) en la que además de los dispositivos de citometría ya mencionados se dispone de mecanismos de separación celular en función de la fluorescencia emitida por las células marcadas con anticuerpos. Esta es la técnica que actualmente ofrece mejores resultados.

TECNICAS USADAS EN EL AISLAMIENTO DE ANTICUERPOS O ANTIGENOS PUROS.

Esta técnica es ampliamente utilizada en Bioquímica e Inmunología. Puede aplicarse en el aislamiento de una población pura de anticuerpos. Para ello se prepara un inmunoabsorbente en fase sólida, que es un antígeno unido covalentemente a un soporte inerte, como por ejemplo bolitas de dextrano entrecruzadas. El inmunoabsorbente, se coloca en una columna y la mezcla de anticuerpos se hace pasar a través de él bajo condiciones fisiológicas. Los anticuerpos específicos para el antígeno permanecen unidos a la columna, y aquellos que no se unen son eliminados mediante lavado. En el segundo paso, se eluye la columna, usando un tampón de elución que disocia la unión antígeno-anticuerpo (por ej., acetato a pH 3.0) para obtener el anticuerpo que se unió al inmunoabsorbente. A la inversa, colocando anticuerpos en la columna se tendrá antígeno puro. Esta técnica permite obtener otros tipos de moléculas. Así una columna de lectina absorberá todas las moléculas con determinados residuos azúcar, que pueden eluirse en un tampón con el azúcar libre, ya que éste compite con la proteína ligada por los sitios de unión a la lectina.

INMUNOPRECIPITACION E INMUNOBLOTTING  

La inmunoprecipitación es una de las técnicas inmunológicas más útiles cuando se asocia a electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida. De este modo se pueden determinar la presencia y cantidad de un antígeno, el peso molecular relativo de una cadena polipeptídica, su síntesis y degradación, la interacción con proteínas, ácidos nucleicos u otros ligandos. La técnica de inmunoprecipitación se divide en cuatro pasos (Figura 17.17):

1.       Marcaje del antígeno (opcional)

2.       Lisis de las células para liberar el Ag

3.       Formación del complejo Ag-Ac

4.       Purificación de los inmunocomplejos

En la mayoría de los casos el antígeno se marca incubándolo con un precursor radiactivo aunque muchos antígenos se pueden detectar por medios que no requieren marcaje directo. El antígeno se extrae de las células mediante lisis. Después, los anticuerpos se añaden al lisado y se forman los inmunocomplejos Ag-Ac. Estos se unen por adsorción a una fase sólida que contiene proteína A.

Los inmunocomplejos se analizan generalmente por electroforesis en gel pero también pueden ser usados en diferentes técnicas incluyendo estudios enzimáticos, unión a ligandos, inmunizaciones, inmunoblotting, etc.

Una de estas técnicas es el Western blot que combina la resolución de la electroforesis en gel con la especificidad de la detección inmunoquímica. Se utiliza para determinar la presencia y cantidad de antígenos y de anticuerpos específicos. En la actualidad es el test confirmatorio más empleado para el diagnóstico del SIDA. Se emplean antígenos virales obtenidos por cultivo celular. Mediante electroforesis se separan las diferentes proteínas víricas por su diferente peso molecular. Posteriormente se transfieren a papel de nitrocelulosa y secundariamente se incuban con el suero problema. Los anticuerpos se detectan añadiendo una anti-IgG humana marcada con una enzima (peroxidasa) que produce una banda coloreada al añadir un sustrato. Esta técnica identifica anticuerpos específicos frente a las distintas proteínas del VIH.

OTRAS TECNICAS BASADAS EN LA UNION ANTIGENO-ANTICUERPO

Hay otros modos para detectar el complejo antígeno-anticuerpo una vez que éste se ha formado, además de los descritos en los apartados anteriores. Son, por ejemplo, las técnicas basadas en el marcaje de anticuerpos con ferritina u oro coloidad, de gran utilidad en microscopía electrónica.

La técnica de anticuerpos marcados con ferritina se basa en el hecho de que casi el 25% de esta molécula está formada por hierro que, al ser opaco a los electrones, puede ser detectado en microscopía electrónica. Los anticuerpos pueden ser combinados a la ferritina (u otras proteínas) mediante ligandos bivalentes como el 1,3-difluoro-4,6-dinitrobenceno o la bencidina bidiazoica entre otros.

La técnica basada en el marcaje de anticuerpos con oro coloidal y su uso en microscopía electrónica se basa, al igual que en el caso anterior, en la opacidad de estas moléculas a los electrones. Estas técnicas son de gran utilidad en inmunohistología e inmunocitología humana, animal y vegetal.

También están tomando cada vez mayor auge las técnicas quimioluminiscentes. La quimioluminiscencia consiste en términos generales en la producción química de la luz. Los marcadores quimioluminiscentes son sustancias capaces de emitir luz cuando, al  absorber la energía de una reacción química oxidativa, son colocadas en un estado de excitación electrónica. La emisión de luz se produce al volver a su estado inicial y la energía química absorbida se cede en forma de fotones fácilmente cuantificables con un fotodetector. Los marcadores quimioluminiscentes constituyen una alternativa al uso de isótopos radiactivos en el inmunoanálisis, pues los compuestos quimioluminiscentes son de gran estabilidad y la emisión de luz sólo se produce cuando se provoca la reacción oxidativa siendo posible almacenar largo tiempo los compuestos luminiscentes.

Las técnicas anteriores así como las de inmunofluorescencia, radioinmunoanálisis e enzimoinmunoensayo pueden realizarse utilizando un sistema de ampliación de las señales empleando el complejo avidina-biotina. La biotina es una vitamina de bajo peso molecular, y la avidina es una glicoproteína, contenida en la clara del huevo. La biotina se une covalentemente al anticuerpo a través de un grupo amina, carboxilo sulfhidrilo o tiosil. Varias moléculas de biotina, pueden unirse a una de anticuerpo y dada la afinidad biotina-avidina resulta que, cada molécula proteica, se vería unida, a través de la biotina, con varias moléculas de avidina a su vez unidas al marcador correspondiente.

TECNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR UTILES EN INMUNoLOGIA.     

Otro grupo de técnicas ampliamente utilizadas en inmunología son de biología molecular. Una de las mas utilizadas es la Southern Blot. Esta técnica  consiste en la separación de fragmentos de  DNA previamente obtenidos por digestión con enzimas de restricción. La separación se hace mediante electroforesis y después este DNA es transferido a membranas de nylon o nitrocelulosa (blot). Después, para la identificación de la banda que interesa se realiza un proceso llamado hibrización, en el que la membrana es "incubada" con un fragmento de DNA complementario al gen de interés (sonda) previamente marcada, generalmente con un isótopo, lo que permite posteriormente visualizar mediante autoradiografía la banda en la cual se ha producido unión (Figura 17.18),

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