14 Citotoxicidad

J. M. Lozano, R. Tarazona y J. Peña

Fases Activación Lítica lisis por macrófagos Receptores tipo TOLL Opsonización

Introducción

La citotoxicidad celular constituye uno de los mecanismos efectores de determinadas poblaciones celulares especializadas del sistema inmunitario, consistente en la capacidad para interaccionar con otras células y destruirlas. Cualquier tipo celular, normal o patológico, puede ser potencialmente susceptible a las células citotóxicas, y se emplea gráficamente el término "células diana" (target cells)  para su designación.

Este mecanismo de respuesta interviene en la defensa frente a infecciones víricas y células neoplásicas, así como en la destrucción de células alogénicas en transplante de órganos. Se consideran como prototipos de las células especializadas en dicha función a una subpoblación de linfocitos T (Tc, CTL o cytotoxic T lymphocyte) y a las células natural killer (NK). Otras células como  los macrófagos ejercen  también una  importante  función citolítica y  serán  tratados al final del capitulo.

Desde que se definió el fenómeno de citolísis, es sabido que la  función citotóxica exige de una actividad metabólica activa de la célula a temperatura fisiológica, no implica la síntesis "de novo" de proteínas, y requiere tanto la presencia de cationes divalentes (Ca²⁺ y Mg²⁺) como la integridad del citoesqueleto.

Las diferentes fases del proceso lítico están  reguladas por diversos tipos de receptores con acciones a veces contrapuestas, y el efecto final es la consecuencia del equilibrio que en cada momento se alcance. El proceso lítico es una acción que se desarrolla en fases  sucesivas que se inicia con el reconocimiento  de las células implicadas en el proceso y termina con la lisis de la célula diana.  

Las principales etapas en las que se desarrolla el proceso de citolisis  son  las siguientes::  

1. Fase de reconocimiento y adhesión intercelular. Las células efectoras interaccionan a través de diferentes receptores de superficie con estructuras en la membrana de la diana. Esta fase es dependiente de Mg²⁺, no requiere Ca²⁺ y puede producirse por debajo de la temperatura fisiológica (Figura  14.1).

2. Fase de activación de la célula efectora.  La interacción de los receptores de superficie con sus ligandos determina la transducción de señales a la célula que conllevan la generación de segundos mensajeros, la aparición de cambios estructurales y la exocitosis del contenido de los gránulos de secreción al espacio intercelular, tras la fusión de los mismos con la membrana plasmática.  

3. Fase lítica . Esta etapa viene determinada por la acción de diferentes componentes de la célula efectora sobre la diana, la cual experimenta una serie de complejas alteraciones que inician su desestructuración. Tanto esta fase como la anterior son dependientes de Ca²⁺ .

4. Fase de disociación del contacto intercelular. Permitiendo que la célula efectora inicie potencialmente un nuevo ciclo lítico, a la par que prosigue la destrucción de la célula diana. En la figura 14.2, se observa una célula NK unida a una célula tumoral en lo que puede ser un proceso de citolisis mediado  por este tipo de células.

Existen muchas formas de citotoxicidad mediada por células según la célula que intervine, principalmente participan célula NK  o   CTL (Figura 14. 3).

FASE DE  ADHESIÓN INTERCELUlAR.   

De forma esquemática, se admite que la fase de contacto y adhesión intercelular implica la participación coordinada de dos tipos de receptores, el primero determina  la especificidad/selectividad de la interacción, mientras que el segundo grupo desempeña un papel complementario, no menos específico .  

Reconocimiento por linfocitos Tc

Como se ha visto en capítulos anteriores, la estructura implicada en el reconocimiento específico por las células Tc es el receptor para antígeno (TCR). La mayoría de las células citotóxicas alfa/beta están incluidas en la subpoblación CD8+ y, en consecuencia, reconocen los péptidos antigénicos presentados por las moléculas del MHC de clase I.

La mayoría de los linfocitos Tc se encuentran in vivo quiescentes, por lo que algunos autores los denominan en la literatura pre-CTL, y únicamente despliegan su capacidad funcional tras la activación, en la que tiene un papel central la interleucina 2 (IL-2), citocina que también estimula la división mitótica de los CTL. Así pues, el pleno desarrollo de la respuesta citotóxica específica requiere la participación de linfocitos Th.  

Una subpoblación minoritaria de células T expresa en su membrana receptores específicos para el Fc de la IgG de tipo III (FcgammaR-III), también conocidos como CD16. Dichas estructuras presentan baja afinidad por la IgG monomérica, pero interaccionan eficazmente con inmunocomplejos. En aquellas situaciones en las que la IgG se halla unida específicamente al antígeno sobre la superficie de otra célula, el FcgammaR-III CD 16 desencadena el proceso citolítico con la misma eficacia que el CD3/TCR, denominándose a este mecanismo citotoxicidad dependiente de anticuerpos (antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity o ADCC) (Tabla 14.1).

El segundo grupo de receptores que intervienen en la regulación del proceso citolítico incluye diferentes moléculas de adhesión, ya tratadas más extensamente en capítulos anteriores. Estas estabilizan el contacto intercelular al unirse a sus ligandos en la superficie de la célula diana, aumentando la avidez de la interacción; por otra parte, también participan activamente en la transducción de señales a la célula, complementando el efecto central de los receptores específicos. 

Reconocimiento por células NK 

Las células NK utilizan diversos receptores para reconocer a las células blanco, tal y como hemos visto en el capítulo dedicado a las células NK. Entre estos receptores destacan el CD16,  ciertos receptores de activación y otro grupo recientemente descrito de receptores que tienen como ligando moléculas de histocompatibilidad clase I (Tabla 14.1). 

fase de activación de  CELULAS  EFECTORAs.   

Los estudios ultra estructurales de las células citotóxicas, tras la interacción con la célula diana, demuestran una serie de cambios que se relacionan directamente con la actividad lítica, muchos de ellos ya han sido estudiados en capítulos anteriores.  Sin embargo hemos de considerar de manera específica que la preparación de las células efectoras para la lisis de una célula diana,  implica al menos tres aspectos de especial importancia. Estos son: 

• reorganización del citoesqueleto con localización del centro organizador de microtúbulos (MTOC) y de los centriolos próximos a la zona de contacto intercelular,

• polarización del aparato de Golgi y de los gránulos de secreción en la misma zona y

• fusión de los gránulos con la membrana plasmática y la subsiguiente exocitosis de su contenido al espacio intercelular. 

Por otra parte, la  activación celular pude  inducir la biosíntesis y secreción de citocinas, particularmente IFN-gamma y TNF-alfa.

fase lítica.  

Los linfocitos T citotóxicos  y las células NK destruyen las células dianas a través de la liberación de los factores citotóxicos tales como perforina y granzymes mediante el proceso de exocitosis de los gránulos donde se encuentran almacenados (Tabla 14.2). La consecuencia es la muerte celular de la célula blanco por necrosis. Sin embargo existe otra vía de lisis celular, conocida como apoptosis e implica   la participación del receptor de superficie FasL  de la célula efectora que tras su unión al receptor  Fas de la célula diana induce su muerte por fragmentación de su DNA (Figura 14. 4).

Citotoxicidad por necrosis.

Como consecuencia de la interacción con las células citotóxicas, se aprecian una serie de cambios en la célula diana que conducen a su destrucción. Por una parte, se objetiva una permeabilización de la membrana plasmática, que altera el intercambio iónico y permite la salida de macromoléculas al exterior, perturbando el equilibrio osmótico/oncótico. Este mecanismo es similar al que se produce como consecuencia de la acción del sistema de C' a través del complejo de ataque a membrana (MAC). El fenómeno puede apreciarse in vitro por la liberación del isótopo ⁵¹Cr, con el que previamente se marcan las células diana en el laboratorio, constituyendo el fundamento técnico del ensayo convencional para estudiar estos procesos.

Múltiples observaciones señalan que el proceso citolítico resulta de la acción lesiva sobre la membrana de la célula diana, ejercida por elementos moleculares presentes en los gránulos de secreción, cuando son liberados al espacio intercelular. De hecho, los gránulos aislados presentan cierta capacidad lítica frente a eritrocitos, indicando que al menos algunos de sus componentes están implicados como mediadores moleculares en el proceso (Figura 14.5). Estos gránulos azurófilos, característicos de las células citotóxicas, son estructuras con un núcleo electrodenso rodeado de cuerpos vesiculares y poseen pH ácido. Dado que comparten propiedades con los lisosomas y los gránulos de secreción, se ha propuesto el término descriptivo granulosoma para designarlos. El contenido de estos gránulos  ha sido parcialmente definido, y entre ellos destacan ciertos enzimas  y las moléculas de perforinas. 

Enzimas granulares. Se ha demostrado que dentro de los gránulos se encuentran ciertos  componentes como son varias  serina esterasas, denominadas descriptivamente granzymes o fragmentinas, que se expresan específicamente en linfocitos. Otras enzimas detectadas en los gránulos son: carboxipeptidasas, catepsina D, aril-sulfatasa y beta-glucuronidasa. También se han identificado proteoglicanos, y dos proteinas denominadas TIA-1 o nucleolisina y TIAR (TIA-related), que unen poliadenilato.

Perforinas. Además en estos gránulos se encuentran  la proteína, denominada perforina o proteína formadora de poros (PFP). Esta molécula está constituida por monómeros de 68-70 kDa que se localizan en los gránulos, y presenta la propiedad de interaccionar con fosfolípidos de la membrana plasmática. El resultado es la exocitosis del contenido de los gránulos en la membrana plasmática de la célula diana. Al ponerse en contacto la perforina con el calcio intercelular  polimeriza. La polimerización de varias subunidades de perforina forma estructuras tubulares (aprox. 16 nm de diámetro), identificables por microscopía electrónica, que constituyen canales y permeabilizan la membrana plasmática. Los canales de perforina, hacen que la célula diana sea incapaz de regular los niveles de  agua e iones, produciéndose un desequilibrio osmótico y su lisis. Las propiedades funcionales de la perforina son similares a las del componente C9 del sistema de C,' que forma parte del MAC y, de hecho, se aprecia al comparar la estructura de ambos genes cierta homología estructural en una parte de la secuencia. Por estos poros penetra también la granzyme en  la células diana ejerciendo así su efecto citotóxico sobre esta.  Esta no es la única  forma de entrada de la granzyme  pues también puede intervenir en la entrada de perforina catión independiente manosa 6-P- receptor (CI-MPR).

Además de estos componentes en este tipo de muerte celular tiene especial importancia el factor TNF que puede ser reconocido por ciertos receptores y actuar desencadenando la citolisis de la células blanco. 

Citotoxicidad por apoptosis.

La demostración de un nivel adicional de complejidad del proceso citotóxico provino de los estudios de Russell, al observar que se producía en las células diana una degradación del ADN en múltiples fragmentos de las subunidades nucleosomales. Este fenómeno podía apreciarse por análisis electroforético, en algunos casos antes incluso de que se objetivara la permeabilización de la membrana plasmática. En función de estos datos se propuso que, como consecuencia del proceso citotóxico, se produce la activación de endonucleasas de la propia célula diana, por un mecanismo denominado muerte celular programada o apoptosis, diferente de la muerte por necrosis (Tabla 14.3).

Se considera que la apoptosis es un proceso básico de regulación fisiológica del desarrollo en diferentes sistemas celulares y puede desencadenarse por la acción de mediadores fisiológicos o farmacológicos, así como por la  carencia de factores de crecimiento.

 La interacción del ligando fisiológico (Fas-L) con la molécula Fas pone en marcha la cascada de acontecimientos de lisis celular (Figura 14.6).

El proceso de apoptosis consta de tres fases:

1.     Fase de iniciación, que se inicia con una inducción dependiente del estímulo de muerte y seguida por la fase de transducción de señales correspondiente. El estímulo inductor es muy variado incluyendo agentes químicos y físicos, activadores fisiológicos, asociados a terapias, y toxinas,  también puede iniciarse por unión de Fas a su ligando. En cualquier caso, se entra en una ruta de transducción de señales activada tras el daño que el estímulo produce en las macromoléculas biológicas, o por acción sobre receptores específicos (CD95/Fas/TNF-R).

2.    Fase efectora, en la que la célula está programada para morir, activándose las enzimas proteolíticas encargadas del proceso, denominadas caspasas. Este punto aparece claramente modulado por la familia de proteínas bcl-2, las cuales regulan la fase efectora de la apoptosis La proteína Bcl-2 se encuentra asociada a membranas intracelulares,  (mitocondria, retículo endoplásmico y envoltura nuclear. En realidad bcl-2 son un gran grupo de proteínas que dimerizan unas con otras determinando la supervivencia o la muerte, el dímero Bcl-2/Bcl-x inhibe la apoptosis mientras que el dímero bcl-2/Bax la favorece.

3.     Fase degradativa, en la que las células muertas  son reconocidas y fagocitadas por los macrófagos. La muerte celular se produce después de grandes alteraciones nucleares, de la membrana plasmática y de las mitocondrias. En el núcleo se degrada el ADN y se hace visible condensaciones de cromatina nuclear formándose aglomeraciones que se desplazan hacia la superficie de la membrana nuclear. 

LisIs MEDIADA POR MACRÓFAGOS  

Del mismo modo que las células NK y linfocitos T CD8⁺,  los macrófagos poseen capacidad citolítica de otras células o incluso detritos celulares o células en proceso de muerte. Especialmente los macrófagos poseen capacidad de destruir microorganismos una vez fagocitados o bien de manera extracelular (Figura 14.7). 

Para desarrollar este efecto los macrófagos   poseen receptores especializados en el reconocimiento del material a fagocitar y una maquinaria especialmente desarrollada para la lisis ya sea intracelular como extracelular (Figura 14.8.). 

Receptores de macrófagos 

Los macrófagos  poseen  receptores de diferente tipo que hacen posible el fenómeno de reconocimiento, entre ellos destacan:  

1.   Receptores Fc (FcRI y FcRIII de alta afinidad) y así pueden ser dirigidos    contra células recubiertas de anticuerpos, participando en las reacciones líticas por  ADCC.

2.   Receptores depuradores o “scavenger” y

3.   Receptores tipo TOLL

4.   Receptores inhibidores (ILT y otros) 

Receptores tipo Toll  

El reconocimiento de los patógenos por los macrófagos y otras células de la respuesta inmune innata, es mediado por un grupo de receptores que están codificados en la línea germinal y a los que se ha denominado receptores de reconocimiento de patrón (Pattern-recognition receptors, PRRs). Estos receptores reconocen patrones moleculares conservados presentes  en los microorganismos patógenos pero no en los tejidos propios, a los que se denomina Patrones moleculares asociados a patógenos (Pathogen-associated molecular patterns, PAMPs). Estos patrones moleculares son esenciales para la supervivencia y patogenicidad del microorganismo y son capaces de inducir una fuerte respuesta del sistema inmune innato. Este mecanismo de reconocimiento permite a las células fagocíticas poner en marcha un sistema rápido de defensa, sin embargo, carecen de memoria inmunológica y no pueden mejorar su respuesta tras un segundo contacto con el mismo patógeno.

Entre los receptores de membrana que participan en  la respuesta inmune innata implicados en reconocimiento de patógenos se pueden distinguir los receptores endocíticos que participan en el proceso de fagocitosis y los receptores activadores que inducen otras respuestas inmunes como la secreción de citocinas y quimioquinas. 

La activación de los receptores endocíticos pone en marcha las diferentes fases del proceso de fagocitosis, que resulta en la ingestión y destrucción de las partículas o microorganismos fagocitados. Entre los principales receptores implicados en el proceso de endocitosis destacan los receptores depuradores (scavenger receptors) presentes principalmente en macrófagos y que participan en la eliminación de microorganismos y de lipoproteinas modificadas (oxidadas o acetiladas) (Tabla 14.4),  , los receptores de manosa y los receptores de glucano presentes también en células dendríticas. Los principales receptores endocíticos  así como sus ligandos están representados en la Tabla 14.5 y Figura 14.9.

 Entre los receptores activadores destacan el receptor de LPS (CD14) y los receptores Tipo Toll (Toll-like Receptors, TLR). Los receptores Toll se describieron por primera vez en Drosophila (mosca del vinagre) y participan en la respuesta inmune frente a hongos induciendo la síntesis de péptidos antimicrobianos. Posteriormente se describieron sus homólogos en mamíferos denominándose  receptores tipo Toll (Toll-like Receptors, TLR). Poseen especificidad en el reconocimiento de Patrones moleculares asociados a patógenos (PAMPs) y se ha demostrado que juegan un papel importante en la iniciación de la respuesta inmune. En mamíferos, los TLRs se expresan en diferentes células del sistema inmune como neutrófilos, macrófagos y células dendríticas, además se ha detectado su presencia en algunas subpoblaciones de linfocitos. Se localizan en la membrana de las células de la respuesta inmune innata y tras la fagocitosis de microorganismos los TLR pueden movilizarse y encontrarse en fagosomas (Figura 14.10). 

Los TLRs son proteínas transmembrana tipo I. Los dominios extracelulares poseen repeticiones ricas en leucina y presentan una estructura muy conservada entre insectos y humanos. El dominio intracelular tiene homología con el de los receptores para IL-1 y se denomina TIR (Toll-IL-1R). Este dominio TIR se asocia a proteínas adaptadoras con un elevado grado de homología como es la proteína MyD88. 

Los diferentes TLRs identificados hasta el momento difieren en los ligandos que reconocen, en el patrón de expresión y probablemente los genes que inducen. Los TLRs están implicados en el reconocimiento de una gran variedad de PAMPs. En mamíferos se han identificado diez receptores tipo Toll si bien algunos de los ligandos no han sido aun identificados (Tabla 14.6). 

Los TLR se pueden asociar a otras moléculas o co-receptores para el reconocimiento de microorganismos. Así, TLR4 reconoce LPS tanto en macrófagos como en linfocitos B y requiere la asociación con CD14 y otras proteínas como MD2 en macrófagos o MD1 y RP105 en linfocitos B.

La activación del TLR, tras reconocer a su ligando específico, induce una cascada de señales intracelulares.  Los TLRs interaccionan a través  de su dominio TIR con la proteína adaptadora MyD88.  MyD88 se une por su dominio de muerte a IRAK, una serin treonin kinasa, que se autofosforila. Tras la unión de IRAK con TRAF6 se inicia la cascada TRAF6-IkK. IkK activado fosforila IkB e induce su degradación y la liberación de NFkB que se transloca al núcleo e inicia la  transcripción y síntesis de genes. La activación de los TLR estimula la producción de citoquinas y quimioquinas, así como inducen la expresión de moléculas co-estimuladoras. Además, pueden inducir la síntesis de péptidos antimicrobianos con capacidad de lisar microorganismos (Figura 14.11). 

La activación de los TLRs en las células dendríticas induce su maduración, produciendo cambios en la expresión de receptores de quimioquinas que van a favorecer su movilización a los ganglios linfáticos, producción de citoquinas proinflamatorias (IL12, TNF-alfa) y aumento de la expresión de moléculas co-estimuladoras (CD40, CD80, CD86)  Las células dendríticas maduras poseen mayor capacidad de actuar como APC y estimulan a los linfocitos T e inician la respuesta inmune adaptativa. Por tanto, la activación de los TLRs sirve de enlace entre la inmunidad innata y la inmunidad adaptativa

En la regulación de la respuesta inmune innata mediada por macrofagos intervienen también receptores inhibidores. Entre ellos, los macrófagos expresan receptores ILT (Ig-like transcripts) así como el receptor recientemente identificado SIRPa (signal regulatory protein a) que poseen dominios ITIM (Immune receptor tyrosine-based inhibitory motif). El ligando de SIRPa  es CD47 (IAP, integrin associated protein) que constituye una proteína de membrana ampliamente expresada. La interacción de CD47 con SIRPa bloquea la activación celular vía PRRs (Figura 14.12).  Estos receptores inhibidores expresados en las células de la respuesta inmune innata son capaces de inhibir la destrucción de componentes propios del organismo.

Opsonización.   

La fagocitosis es el proceso de ingestión e internalización mediado por células especializadas de material que incluye microrganismos vivos, células alteradas y trozos de tejidos. La fagocitosis se incrementa si el material está recubierto por ciertas proteínas plasmáticas llamadas opsoninas, llamándose en este caso a este proceso de opsonización.

Las opsoninas más importantes son: 

• anticuerpos específicos de clase IgG y

• fragmentos activado del sistema del complemento C3 (C3b) y su forma inactiva (iC3b) y la fibronectina plasmática que actúa como co-opsonina potenciando el efecto del complemento

Las opsoninas son ligandos para receptores específicos de la membrana leucocitaria: la IgG se une a los receptores Fc, y el C3b , el iC3b y la fibronectina a sus respectivos receptores. Una vez unidas a la membrana, las partículas son ingeridas mediante pseudópodos e incluidas en una vesícula ligada a la membrana llamada vacuola fagocitaria o fagosoma.

Posteriormente los fagosomas y lisosomas se unen dando lugar a los fagolisosomas y así la partícula ingerida se expone al efecto degradativo de los enzimas lisosomales, cuya actividad es óptima a un pH de alrededor de 5.0

Mediadores citolíticos en macrófagos 

Los principales mecanismos por los que los macrófagos desarrollan finalmente su capacidad citolítica son :

1.       Liberación de enzimas lisosómicas

2.       Metabolitos reactivos de oxígeno

3.       La formación de óxido nítrico (NO)

4.       Producción  de TNF–alfa

5.       Producción de péptidos anti-microbianos

6.       Producción de lactoferrina

La lisis bacteriana se efectúa mediante mecanismos dependientes o independientes de oxígeno. Los mecanismos dependientes de oxígeno se deben al H₂O₂, a radicales libres como el anión superóxido O₂- y el radical hidroxilo OH.  Estos productos se forman en la explosión respiratoria (Figura 14.13) que sigue a la activación de la NADPH oxidasa de membrana tras la fagocitosis. 

En los fagosomas y en la superficie celular el anión superóxido se convierte mediante la superóxido dismutasa en H2O2. El anión superóxido y el H2O2 son agentes con gran poder bactericida y pueden causar daño celular si salen de los fagosomas. En estos casos el H2O2 es destruido por un enzima citoplasmático llamado glutatión peroxidasa. En la actividad bactericida del H2O2 está implicada la mieloperoxidasa, enzima que en presencia de iones haluro convierte el H2O2 en ácido hipohalúrico. Como el cloruro es el haluro más abundante en los sistemas biológicos, se produce ácido hipoclórico, que es un agente bactericida muy potente. El H2O2 se puede reducir mediante la reacción de Haber-Weiss y formar el radical hidroxilo (OH^-), altamente tóxico.

Finalmente se expone (Figura 14.14.) una visión general donde se observa que los macrófagos forman parte de la respuesta inmune innata y la respuesta adaptativa en sus dos vías, humoral y celular.  

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Capitulo de Inmunología-online coordinado por  J. Peña