04 Genética inmunoglobulinas

I. J. Molina, A. Palma y J. Peña.    

Genes implicados Reordenamiento génico Cambios de isotipo Causas diversidad Exclusión alelica Ac. monoclonales

INTRODUCCION.              

Los linfocitos B, al reconocer  un determinado antígeno mediante las inmunoglobulinas de superficie, se activan, proliferan y diferencian hasta células plasmáticas que poseen la propiedad de sintetizar y secretar inmunoglobulinas en grandes cantidades. La síntesis de inmunoglobulinas, como glicoproteínas que son, se efectúa en los ribosomas de las células plasmáticas, donde tiene lugar la traducción de RNA mensajero correspondiente a las cuatro cadenas peptídicas. Posteriormente se producirá el proceso de la glicosilación de dichas cadenas y la secreción de las mismas.

El conocimiento de la heterogeneidad de las inmunoglobulinas debida a su diversidad de clases y a la gran variabilidad estructural derivada de la parte variable de las mismas, ha producido, a su vez, una gran inquietud por conocer a nivel genético el proceso de regulación y síntesis de estas moléculas.

Hoy  ya conocemos  los mecanismos más relevantes por los cuales el  organismo es capaz de sintetizar millones de moléculas de inmunoglobulinas diferentes con una cantidad de material genético limitado.

GENES  IMPLICADOS EN LA SÍNTESIS DE INMUNOGLOBULINAS.   

A partir de los estudios de Tonegawa en 1976, aparece un acumulo de conocimientos por los que se sabe que la síntesis de las cadenas ligeras y pesadas se regula por genes que se encuentran en cromosomas distintos (Figura 4.1).

Esto  fue puesto de manifiesto empleando técnicas de digestión enzimática del DNA de células B y posterior  hibridación con sondas de DNA complementario (cDNA), mediante la técnica de Southern Blot (ver capitulo Métodos). Mediante esta técnica, se pudo observar que usando un cDNA marcado radioactivamente como sonda correspondiente a parte de una cadena pesada, éste se unía a segmentos de DNA de líneas celulares de ratón que contenían el cromosoma 12. Por otra parte, empleando igualmente sondas de cDNA marcadas radioactivamente frente al DNA de cadenas ligeras de tipo k, éstas se unen a células que contienen el cromosoma 6, mientras que las sondas para DNA de cadenas ligeras l lo hacen al cromosoma 16. En la tabla 4.1 se especifica, tanto en humano como en ratón, el cromosoma donde se encuentran estos segmentos de genes.

Segmentos de genes y síntesis de inmunoglobulinas.

Otra característica importante de la formación  de inmunoglobulinas es que, en la síntesis de cada una de las cadenas de inmunoglobulinas participan varios segmentos de genes de cuyas combinaciones resultan los diversos genes funcionales, responsables directos de la codificación de cada una de las cadenas de inmunoglobulinas. Esto explica las múltiples posibilidades de formación del gran número de inmunoglobulinas partiendo de un limitado material genético. La codificación multigénica de las inmunoglobulinas fue demostrada también por Tonegawa analizando DNA de células embrionarias de ratón y de un mieloma también de ratón.

Tipos de segmentos génicos

Estos segmentos codifican por separado la parte variable, la parte constante y las partes por las que ambas regiones se unen, esto es, las regiones bisagra. Los segmentos que codifican la parte variable son de dos tipos, segmentos V y segmentos D, responsables de la variabilidad y diversidad de las inmunoglobulinas respectivamente. Le siguen los segmentos J o de unión, responsables de unir los fragmentos anteriores con los  segmentos C que codifican para la parte constante. El número de segmentos responsables de la codificación de la parte constante  es muy limitado en relación con el número de segmentos que codifican la parte variable de las inmunoglobulinas (Figura 4.2).

En las células embrionarias los segmentos de una misma clase se encuentran separados del resto de tal forma que, por una parte, se encuentran los segmentos V, por otra los D, los J y los C. Estos segmentos están contenidos en los exones, que son aquellos fragmentos de DNA que serán transcritos para dar lugar a la síntesis de proteínas, y que se encuentran separados entre sí por fragmentos de DNA no codificadores de proteínas denominados intrones.

En consecuencia se puede concluir que: La síntesis de las cadenas ligeras y pesadas de las inmunoglobulinas está regulada por cromosomas distintos. En esta síntesis participan varios segmentos de genes que combinados dan lugar a los genes funcionales responsables de la codificación de las cadenas de las inmunoglobulinas.

REORDENAMIENTO DE LOS SEGMENTOS GENICOS DE LAS INMUNOGLOBULINAS.  

Las observaciones anteriores se interpretaron como que a lo largo del proceso madurativo de los linfocitos B, se produce un reagrupamiento de segmentos de genes para la iniciación de la síntesis de las cadenas ligeras y pesadas. A este fenómeno se denomina recombinación intracromosómica. 

 A medida que se produce el proceso madurativo de los linfocitos B, los segmentos V, D y J cambian de sitio en el cromosoma de tal manera que se colocan juntos. Posteriormente este conjunto V/D/J se reagrupa con el segmento C correspondiente quedando constituido en consecuencia un gen con toda la información de la cadena. Cuando el linfocito B es maduro posee ya reagrupados los genes correspondientes a sus cadenas ligeras y pesadas y sólo podrá producir un determinado tipo de anticuerpo.

Reordenamiento de  genes  de cadenas ligeras

En la síntesis de cadenas ligeras participan los segmentos V, J y C (es decir, no hay genes D para la cadena ligera). Así pues, en el proceso de recombinación de genes de cadenas ligeras se acopla un segmento V con un segmento J y el conjunto V/J se recombina con el segmento correspondiente a la parte constante C. El proceso de transcripción se hace de tal manera que el RNA mensajero contiene información secuenciada V, J y C. En la Figura 4.3 se esquematiza el proceso de recombinación y trascripción ocurridos en la línea celular B conducente a la síntesis de cadenas k.

Reordenamiento de genes de cadenas pesadas

A su vez, un proceso similar, si bien esta vez en dos etapas, ocurre para la formación de una cadena pesada. En este caso  participan los segmentos V, D, J, y C. Primero se produce la recombinación entre un segmento D y un segmento J. En la segunda fase, este conjunto D/J se recombina con un segmento V. El complejo V/D/J se puede por último recombinar con cada uno de los segmentos que codifican las regiones constantes, según la inmunoglobulina a formar. El proceso de recombinación con los genes C tiene lugar a nivel de RNA. Vamos a encontrar en este momento el siguiente orden: el segmento líder; un fragmento V/D/J reordenado y unido y a continuación  cada uno de los genes que codifican para las regiones constantes (C_m; C_d; C_t, etc) separados entre sí por los correspondientes intrones y a su vez precedidos por sus respectivos promotores. Se piensa que el gen C_m es el situado en primer lugar en la secuencia de genes C, seguido de C_d. En células B en reposo, el único y largo tránscrito primario de RNA va a contener la información del complejo V/D/J más la correspondiente a los genes C_m y C_d. Mediante mecanismos de procesamiento del RNA que analizaremos posteriormente, se va a proceder a la escisión en el tránscrito primario de la información correspondiente a C_m o bien a C_d. Se da lugar de esta manera a una inmunoglobulina de tipo IgM o IgD, y este mecanismo es además el responsable de que en las células B en reposo se encuentre la expresión simultánea de ambas inmunoglobulinas. 

En la Figura 4.4 se esquematiza el proceso de recombinación y transcripción ocurrido en la línea celular B concerniente a la síntesis de cadenas pesadas en este caso del tipo m3.  En este caso la recombinación se ha producido entre VH3, D1, JH2, responsables de la parte variable de la cadena pesada que se ha recombinado con la parte constante del segmento del gen Cg3, que originará la cadena pesada correspondiente a la IgG3. En el caso de los genes V de las cadenas pesadas, al igual que hemos visto para las cadenas ligeras, junto a su segmento génico se encuentran las estructuras lider y cerca de las mismas se sitúan las secuencias promotoras.  

Segmentos lider  y promotores.

Asociados a los segmentos V y situados en dirección 5' de los mismos, existen otros segmentos génicos conocidos como segmentos líder (L).  Estos segmentos génicos codifican un péptido pequeño que servirá de guía tanto para las cadenas ligeras como pesadas a su paso por el  retículo endoplásmico pero que se separa de estas cadenas antes de que las mismas se unan entre sí para formar la molécula completa de inmunoglobulina. Junto a estos segmentos génicos se sitúan otros conocidos como segmentos promotores y que son responsables  de iniciar la señal del proceso de transcripción del mRNA.

La secuencia promotora comienza normalmente a una distancia de alrededor de 25 pares de bases antes del lugar de inicio de la transcripción y continúa alejándose del mismo en dirección 5', aunque su localización y longitud no son siempre las mismas. El lugar preciso de la iniciación de la transcripción es reconocido por la combinación conservada de cuatro bases en las que se alternan timina y adenina, para formar lo que se conoce como caja "TATA", siendo continuada por el triplete de bases que codifica el aminoácido metionina, que suele ser el primero codificado de manera casi constante en la mayoría de los genes eucarióticos.

Dentro de las secuencias promotoras, vamos a encontrar  los denominados motivos de secuencias, esto es, secuencias del DNA a las que se van a unir de manera específica ciertas proteínas nucleares que son las que van a regular su función. En definitiva, las proteínas que van a unirse a estos motivos en el DNA van a regular, en última instancia, la transcripción del DNA, por lo que también estos factores o proteínas de unión son conocidos como factores transcripcionales. En el caso de los genes de las inmunoglobulinas, encontramos en la región promotora la presencia conservada de un octámero (secuencia de ocho bases) en la región 5' no traducida de los genes V_k, mientras que la secuencia complementaria pero invertida de este octámero es encontrada en los genes V_H. La presencia de este octámero se ha revelado de gran importancia en el control genético de la síntesis de inmunoglobulinas, en tanto que confieren a las regiones promotoras de los genes de las inmunoglobulinas contenidos en las células B no sólo de especificidad tisular (esto es, sólo las células B producen inmunoglobulinas), sino que además es necesaria para la adecuada función del promotor. Esto parece alcanzarse mediante la unión específica de varios factores transcripcionales, entre los que señalamos los conocidos como Oct-1, Oct-2 y Oct-3. De manera general, los promotores eucarióticos pueden contener varias regiones de unión específicas para cada uno de los factores de transcripción que regulan su función. 

Regulación del proceso de reordenación de las inmunoglobulinas. 

Este complejo proceso de recombinación que hemos estudiado hasta ahora ha de tener, necesariamente, un mecanismo de regulación muy estricto. Este mecanismo está constituido por, al menos, los genes RAG-1 y RAG-2 (genes actividores de la recombinación 1 y 2).  

Genes RAG-1 y RAG-2

Estos genes fueron descubiertos en el laboratorio de David Baltimore en 1990. El descubrimiento previo de que cada uno de los genes V, D y J era precedido de una corta secuencia única de DNA cuya función es la de servir de señal para los procesos de recombinación, y que es conocida como secuencia de señal de recombinación (SSR) permitió la identificación de estos genes. Utilizando un sistema experimental de transfección en diversas células de vectores retrovirales conteniendo genes de resistencia al ácido micofenólico como indicador de actividad, y que contenían los genes germinales de V_k y J_k junto con sus SSR, estos investigadores comprobaron que sólo las líneas pre-B y pre-T tenían capacidad de recombinación, lo que indicaba un mecanismo de regulación común a ambas estirpes. Este sistema experimental permitió la posterior identificación de RAG-1, seguido del descubrimiento de un segundo gen (RAG-2) muy ligado al anterior tanto en su localización como en su estructura, y que actuaba de una manera sinérgica con RAG-1 facilitando los procesos de recombinación. El  papel in vivo que  cada uno de estos genes juega en el desarrollo ontogénico del sistema inmune es crítico. Para demostrarlo, se generaron mediante un proceso de ingeniería genética, conocido como gene targeting, ratones que carecían específicamente de RAG-1 o de RAG-2. El análisis de estos ratones demuestra que no se producen fenómenos de recombinación en ninguno de los dos casos, y que como consecuencia, no se encuentran presentes en la periferia ni linfocitos B ni T maduros. Esto indica que los procesos de recombinación génica tanto de los genes del TCR y de las inmunoglobulinas van a estar sometidos a mecanismos comunes de regulación. Aún más importante, se ha encontrado recientemente un grupo de pacientes que tienen mutaciones en RAG-1 o RAG-2, dando como resultado la aparición de una inmunodeficiencia combinada severa por bloqueo en los procesos de recombinación tanto de linfocitos B como T. 

Fenómenos de aproximación de regiones

El proceso de reordenamiento génico, además de juntar los segmentos de genes que formarán la estructura de las futuras cadenas ligeras y pesadas, aproxima las regiones promotoras a las regiones amplificadoras (regiones enhancer), lo cual facilitará  posteriormente la regulación y control del inicio así como la adecuada transcripcion del RNA mensajero correspondiente. Las regiones amplificadoras se localizan normalmente a miles de pares de bases de distancia de las regiones promotoras, en tanto que las regiones amplificadoras pueden encontrarse, según el gen, después de los segmentos J y antes de los segmentos C. Por tanto, este acercamiento implica la formación de un bucle en la estructura espacial del DNA, de manera que la aproximación entre ambas regiones no es lineal, sino espacial. Al igual que en el caso de los segmentos promotores, las regiones enhancer van a contener motivos de unión que van a interactuar con los factores transcripcionales. Uno de los primeros factores en ser descubierto y más relevante funcionalmente es el factor de transcripción NF-kB, que se une a la región amplificadora del gen k. En la Figura 4.5 se muestra un esquema del proceso por el cual se eliminan los segmentos de genes que no se van transcribir.

Unión de segmentos de genes

Otro mecanismo importante en la regulación del reordenamiento de los genes de las inmunoglobulinas es el que controla las uniones entre los genes V, D y J. Es decir, cuales son las señales que hacen que un gen D identifique, dentro del cromosoma, la secuencia de un gen J con el que puede unirse, y, a su vez, el gen V identifique la secuencia del complejo DJ ya formado. Los reconocimientos y uniones de unos genes con otros están controlados por combinaciones de secuencias de DNA que se encuentran conservadas y son únicas de los genes de las inmunoglobulinas. Estas secuencias están formadas por un heptámero palindrómico, un espaciador variable de 23 pares de bases y un nonámero palindrómico (Figura 4.6). Este motivo va a reconocer otro formado por un nonámero de secuencia igual pero invertida al anterior, continuado por un espaciador variable de 12 pares de bases y un heptámero cuya secuencia es, otra vez, igual pero invertida al heptámero anterior. La longitud conservada de los espaciadores no es casual, en tanto que se ha sugerido que 12 pares corresponde a una vuelta de la hélice de DNA, y 23 a dos. Así, los segmentos que contienen  un espaciador de 12 bases sólo se pueden unir a otro de 23. Esto asegura, en el caso de las cadenas pesadas, que los genes se reordenen en el orden correcto.

El mecansimo exacto por el que estas secuencias conservadas regulan la unión de los genes de las inmunoglobulinas no se conoce todavía con exactitud. Los modelos actualmente considerados para explicar este fenómeno implican la formación de un bucle en el DNA, lo que conlleva la aproximación de las secuencias reguladoras entre sí. Al ser los heptámeros y nonámeros de secuencia igual pero invertida, ello hace que al formarse el bucle cada uno de ellos se encuentre con su complementario, permitiendo de esta manera la unión del DNA. Se especula que las recombinasas (que pudieran ser codificadas por RAG-1 y/o RAG-2) tengan a estas estructuras como diana de su mecanismo de acción. Aunque, como ya hemos señalado, no podemos excluir que la actividad recombinasa a este nivel sea modulada por otros genes todavía no descubiertos.

Cambio de isotipo de las inmunoglobulinas.     

Cuando las células B reconocen al antígeno, una población de las mismas secretarán IgM llevando a cabo la respuesta primaria, mientras que, en menor medida, otras células van a comenzar a producir IgG, IgA e IgE. Esto quiere decir que las células B tienen la propiedad de cambiar la subclase o isotipo de las inmunoglobulinas que producen Por tanto, en respuesta a un mismo antígeno se van a generar anticuerpos que van a mantener su parte variable, pero van a ser diferentes en los segmentos constantes que van a ensamblar.

Se cree que el cambio de isotipo se produce por dos mecanismos.  El primer mecanismo implica que  las células B cambian su isotipo tiene lugar esta vez a nivel de DNA, así una célula que ha sido  comprometida  a producir anticuerpos de un determinado isotipo, va a sufrir una delección de todos los genes C a excepción del correspondiente a la subclase que va a ser producida (Figura 4.7). El segundo mecanismo  es conocido como splicing alternativo (Figura 4.8). Este proceso molecular genera polimorfismo proteico debido a la transcripción alternativa de los exones

Estos fenómenos pueden ser influenciados por ciertas citocinas. Así por ejemplo, la IL-4 induce el cambio de isotipo de IgM a IgG1 o bien a IgE.

CAUSAS DE LA DIVERSIDAD DE LAS INMUNOGLOBULINAS.    

La diversidad de las inmunoglobulinas deriva de la variabilidad de las cadenas ligeras y pesadas, por una parte, y por otra  de  las  diversas posibilidades  de unirse entre sí estas cadenas.

La variabilidad  de cadenas, tanto L como H, que un mismo organismo es capaz de producir, se debe  al alto  número de segmentos V existentes, a las diversas regiones J y D también existentes y a la multiplicidad de formas de combinación de V/J, en las cadenas ligeras, y V/J y J/D, en las cadenas pesadas. Es decir, el primer mecanismo de generación de diversidad procede de las diferentes posibilidadaes combinatorias de cada uno de los genes entre sí. Así, si consideramos que para la cadena pesada de las inmunoglobulinas del ratón existen unos 300 genes V_H (aunque éstos pueden llegar hasta 1000), 12 genes D_H y 4 genes J_H, las posibilidades de combinación diferentes son como mínimo de 1.4x10⁴ (300x12x4). A esto hay que añadir las provenientes de las cadenas ligeras. La cadena k tiene 300 genes V_k y 4 J_k, mientras que la l sólo tiene 2 genes V_l (aunque en humanos contiene muchos más) y 3 J_l. Las posibilidades combinatorias son por tanto de 1.2x10³  en el primer caso y de 6 en el segundo. Al necesitarse la unión de cadenas pesada y ligera, las posibilidades combinatorias son las resultantes de multiplicar cada una de ellas (Tabla 4.2). 

Un segundo mecanismo generador de diversidad se debe a la imprecisión de las uniones de los segmentos V, D y J debido posiblemente a desequilibrios en la unión entre los intrones y exones correspondientes, y que se traduce en un pequeño cambio en la estructura primaria de la cadena peptídica. Al parecer este mecanismo desempeña un importante papel en la maduración de la afinidad de los anticuerpos, de tal manera que a medida que progresa la respuesta frente a un antígeno, los anticuerpos formados presentan cada vez mayor grado de afinidad por los epitopos del antígeno. Este mecanismo multiplica por, al menos, nueve las posibilidades combinatorias de los genes de la cadena pesada y por tres las posibilidades de los genes de las cadenas ligeras, en tanto que por término medio se producen tres reordenamientos por cada unión.

Además, toda la diversidad generada por los dos mecanismos ya mencionados, puede verse amplificada por la aparición de mutaciones puntuales en el gen responsable de una determinada cadena de inmunoglobulinas. La ocurrencia de  hipermutaciones somáticas como vía de generación de diversidad se han demostrado al encontrarse cadenas de inmunoglobulinas que, obtenidas del mismo tipo de mieloma, poseían secuencias de aminoácidos ligeramente diferentes a pesar de estar codificadas por un mismo gen. Estas mutaciones somáticas son de gran importancia en los procesos de incremento de la afinidad del anticuerpo. Sabemos que conforme se produce en el tiempo la respuesta de inmunoglobulinas, esta no sólo incrementa el número de moléculas producidas, sino que igualmente lo hace la afinidad de las mismas.

También, hay que indicar que a  la diversidad de las cadenas ligeras y pesadas en sí mismo,  hay que añadir la diversidad derivada de las  diferentes formas de unión de las cadenas ligeras con las pesadas.

EXCLUSION ALÉLICA EN LA SINTESIS DE INMUNOGLOBULINAS. 

Normalmente cada célula productora de anticuerpos sólo expresa un tipo de cadena pesada y otro de cadena ligera. Este fenómeno se produce a pesar de que los genes que codifican estas cadenas se encuentran presentes en los dos cromosomas, uno de origen paterno y otro de origen materno, en tanto que las células productoras de inmunoglobulinas son diploides. Es decir, a pesar de que existan dos copias para cada uno de los segmentos génicos V, D, J y parte constante de las cadenas pesadas y ligeras, sólo una es expresada. De no ser así se generaría un serio problema en el individuo que generaría anticuerpos por una misma célula con especificidades diferentes.

Se piensa que este fenómeno, conocido como exclusión alélica, se debe a que sólo los genes de un cromosoma sufren los procesos de reagrupamiento antes indicados de manera que sólo la información del cromomosoma no reorganizado es  abortada y no se  expresa. Esto implica que una vez que se ha producido una unión productiva V/D/J, los procesos de recombinación son bruscamente detenidos en el otro cromosoma, de manera que no se puede dar lugar a un segundo anticuerpo maduro. El mecanismo exacto por el que se produce la exclusión alélica no está completamente definido. No obstante, se piensa que una vez producido un reordenamiento efectivo de los genes de las inmunoglobulinas, la proteína madura va a enviar una señal negativa de manera que la célula no produzca nuevos reordenamientos. Así, la presencia de un reordenamiento completo de la cadena pesada va suponer el envío de una señal que inhiba nuevos reordenamientos de otras cadenas pesadas, por un lado, y por el otro va a hacer que se inicien los reordenamientos correspondientes a las cadenas ligeras, comenzando por las cadenas k. Si no se produjeran reordenamientos productivos de k, entonces se permitiría el reordenamiento de l. El ensamblaje final de las cadenas pesadas y ligeras impediría nuevos reordenamientos, como ya hemos discutido, mientras que si no se consiguieran reordenamientos productivos en ninguno de los dos alelos de k y l, entonces la célula B entraría en un fenómeno de muerte celular programada, cesando su maduración y siendo posteriormente eliminada. El proceso de exclusión alélica tiene como fin asegurar que cada una de las células B produce un único tipo de anticuerpo, a fin de evitar el reconocimiento de más de un epítopo mediante la producción de anticuerpos multireactivos. 

FASES FINALES DE LA SINTESIS DE INMUNOGLOBULINAS.   

El RNA mensajero correspondiente al péptido a sintetizar se forma mediante la transcripción de los segmentos V, D, J y C ya reagrupados, de manera que la información de estas regiones se transcribe en un solo mRNA al que se añade la cola de poliadenilación (poli-A).  También se transcribe el segmento L (Figura 4.9).

Las partes del RNAm correspondientes a los segmentos intrónicos es eliminada. Esta eliminación implica los procesos de corte del RNAm y posterior unión de los extremos exónicos restantes. Después, el RNAm abandonará el núcleo para alcanzar los ribosomas en donde se producirá la síntesis de los péptidos mediante el proceso de traducción.

En el proceso de traducción en el ribosoma se sintetizan los péptidos. Una vez formados los péptidos de una Ig se produce la glicosilación de los mismos  en el propio retículo endoplásmico, así como su ensamblaje para la formación de  la Ig completa, antes de ser secretada por la célula. El proceso de ensamblaje parece desarrollarse en las siguientes fases: H+H àH2+LàH2L+LàH2L2. En el caso de la IgM, parece que por el contrario se unen primero una cadena pesada con una ligera, uniendose esta media molécula a su otra media independientemente formada.

Una vez que se ha producido el ensamblaje de la inmunoglobulina, esta molécula tiene dos opciones funcionales. Una primera es la de permanecer en la membrana de las células B, convirtiendose de esta forma en el receptor de las células B para el antígeno. La segunda opción es la de ser secretada al medio, con la función de interaccionar directamente con el antígeno y conseguir su destrucción. La única diferencia entre ambas es que las formas de Igs de membrana tienen en la región carboxi-terminal de la cadena pesada un fragmento añadido de 19 aminoácidos. La decisión de optar entre una forma u otra es tomada a nivel de transcripción del RNA, una vez más mediante un proceso de splicing. En el caso que nos ocupa, el proceso  conlleva la transcripción adicional de dos exones (M1 y M2) situados en la región 3' del gen C_H, lo que a su vez da como resultado que se genere el fragmento de 19 aminoácidos que origina una región transmembrana hidrofílica continuada por una muy corta región intracitoplasmática. Si esto ocurre así, se origina el anclaje de la molécula a la superficie celular, dando por tanto lugar a una inmunoglobulina de superficie, mientras que si estos dos exones no son transcritos, la hidrofobicidad conferida a la inmunoglobulina hace que la molécula no pueda anclarse a la superficie y sea secretada.

ANTICUERPOS MONOCLONALES PRODUCIDOS POR HIBRIDOMAS  

Cuando se realiza una inmunización con el objeto de producir anticuerpos frente a un antígeno, se produce una gran variabilidad de inmunoglobulinas que poseen función de anticuerpo frente a los diferentes epitopos del antígeno. Esta produción de inmunoglobulinas es de tipo policlonal debido a que son muchos y muy diversos clonos linfocitarios los que se activan y diferencian para la producción de anticuerpos (Figura 4.10). 

Este fenómeno es de gran utilidad biológica por cuanto ofrecen una amplia barrera de protección del organismo al formarse una gran variabilidad de anticuerpos. Sin embargo, los antisueros así obtenidos, aunque  se han utilizado ampliamente y han sido de gran interés en el conocimiento de la biología y la bioquímica de las inmunoglobulinas (inmunoprecipitaciones e inmunoblotting), ofrecen serias dificultades para su uso, por ejemplo, en la identificación de sustancias u otros fines análogos, debido a la gran heterogeneidad estructural y funcional que poseen.

Este problema se ha obviado desde que Georges Kholer y Cesar Milstein en 1975 (Figura 4.11) consiguieron la producción de anticuerpos monoespecíficos, conocidos como anticuerpos monoclonales (AcMo). Con ello se  abrió un amplio campo en la Inmunología y la Biología Molecular en general puesto que estos anticuerpos son de una gran utilidad por cuanto tienen la capacidad de reaccionar frente a un solo epítopo del antígeno  y son entre si homogéneos.  

Fundamentos de la producción de anticuerpos monoclonales. 

El método seguido para la producción de estos anticuerpos consiste en la unión (fusión) de una célula B productora de anticuerpos , con una célula de gran capacidad de crecimiento (células de  mieloma) con lo cual se forma un híbrido (hibridoma) que posee la información genética necesaria para la síntesis  del anticuerpo deseado, que le es aportada por la célula B, y una activa capacidad de síntesis proteica al tiempo que puede multiplicarse tanto in vivo como in vitro  indefinidamente, propiedades estas últimas que son aportadas por la célula mielomatosa (Figura 4.12). De esta manera, se pueden producir innumerables tipos de hibridomas de acuerdo con el tipo de anticuerpo que interesa. Al ser cada uno de los anticuerpos así producidos homogéneos, ofrecen patrones de reacción de gran especificidad con los  antígenos utilizados en la  inmunización.Kholer y Milstein para la puesta a punto de esta técnica escogieron eritrocitos de oveja como inmunógenos, ya que el anticuerpo contra tales células se detectaba fácilmente mediante la técnica de placas hemolíticas de Jerne. Esta técnica se basa en la detección de la formación de anticuerpos frente a glóbulos rojos de carnero, comprobando la capacidad lítica de los glóbulos frente al complemento. Así, mezclando células de mieloma de ratón con células de bazo procedentes de ratones inmunizados con glóbulos rojos de carnero en presencia de un agente promotor de la fusión celular, identificaron con éxito las células híbridas en un medio selectivo y observaron que segregaban inmunoglobulinas de ambos progenitores. Algunas segregaban anticuerpos contra los eritrocitos. Habían logrado por tanto, aislar clones que segregaban una sola especie molecular de anticuerpo y que, además, podían mantenerse en cultivo. Por primera vez se habían desarrollado cultivos continuos de células híbridas que segregaban un anticuerpo monoclonal de especificidad predefinida.

Una vez seleccionado el hibridoma adecuado, éste puede conservarse largo tiempo congelado. En cualquier momento el clon puede hacerse crecer  para la producción de anticuerpos por inyección a ratones o siembra en cultivo. Generalmente el clon se inyecta intraperitonealmente generándose ascitis extraordinariamente ricas en anticuerpos, de donde son fácilmente purificables. Cuando el clon se ha cultivado in vitro el anticuerpo se recolecta a partir del sobrenadante del cultivo.  

Tecnología de la obtención de AcMo.

Generalmente se comienza por inmunizar a ratones de la cepa BALB/C con el antígeno frente  al cuale se desea obtener el anticuerpo. El protocolo de inmunización suele ajustarse a tres dosis del material antigénico que se administran intraperitonealmente, con intervalos de unas dos semanas. Aproximadamente a los veinte días de la primera dosis, se comprueba la presencia de anticuerpos dirigidos frente al antígeno en el suero del ratón.

Comprobada la presencia de anticuerpos se procede al aislamiento de las células B productoras de los mismos del bazo de los animales, en condiciones de esterilidad. Las células así obtenidas serán utilizadas para su fusión con células mielomatosas, generalmente del tipo NSI.

La línea mielomatosa NSI procede de un mieloma inducido en la cepa BALB/C que ha perdido la capacidad de secretar inmunoglobulinas, por lo que no interferirá en la producción de anticuerpos con los hibridomas que se obtengan. Mientras los linfocitos B, sensibilizados frente al antígeno correspondiente aportan al híbrido los genes que codifican las cadenas ligeras y pesadas de las inmunoglobulinas, la línea mielomatosa dota al híbrido de la capacidad de crecimiento ilimitado propia de las células tumorales y, por tanto, de la posibilidad de desarrollarse tanto in vitro como in vivo.

Esta línea mielomatosa se ha hecho resistente a la 8‑ azaguanina porque carece de la enzima HGPRT (hipoxantin‑guanidin‑ fosforibosil‑trans­ferasa). La síntesis de su DNA la tiene que realizar a través de la vía de novo que obtiene nucleótidos a partir de aminoácidos y azúcares. La aminopterina bloquea la síntesis de novo de nucleótidos, por lo que las células de la línea NSI no sobrevivirán en presencia de este fármaco. Esta característica permitirá eliminar las células NSI que no se han podido fusionar en el medio rico en aminopterina. Las células NSI no fusionadas morirán, mientras que los híbridos podrán seguir creciendo porque poseen la enzima HGPRT, aportada por los esplenocitos.

La fusión celular entre los esplenocitos del ratón inmunizado y la línea  mielomatosa NSI se realiza en el medio de cultivo adecuado que contiene, además de los nutrientes necesarios para un cultivo celular,  polietilen glicol (PEG) que es un detergente capaz de disolver parte de la membrana celular permitiendo así la formación de células que contienen dos núcleos (fusión celular).Posteriormente se procede a la selección de los híbridos que se inicia a partir de las 24 horas después de la fusión. Para ello se añade medio de cultivo con HAT (mezcla de hipoxantina aminopterina y timidina), a cada uno de los pocillos de las placas en donde se encontraban las células en cultivo.

Hacia la tercera semana, se retira la aminopterina de los cultivos añandiéndose medio HT (hipoxantina‑timidina) y, por último, durante la cuarta semana las células se mantienen sólo en medio de cultivo. Terminado este proceso se estudian los sobrenadantes de los híbridos para determinar si producen anticuerpos.

 Los hibridomas productores de anticuerpos se expanden y si siguen siendo positivos se clonan cuando se estabilizan en cultivo.

La clonación tiene como objetivo aislar el hibridoma productor del anticuerpo deseado y que todas las células que lo constituyen procedan de la misma célula progenitora, dado que los hibridomas productores de anticuerpos se encuentran mezclados en cultivo con otros hibridomas que, o bien no son productores o sintetizan anticuerpos que no interesan. 

Utilidad de los anticuerpos monoclonales. 

Un anticuerpo monoclonal es un reactivo biológico homogéneo en su actividad, en contraste con los antisueros convencionales que son una mezcla variable de inmunoglobulinas. El uso más generalizado de los AcMo se centra: 

• En la caracterización y cuantificación de sustancias de interés biológico que se encuentran en cantidades muy pequeñas, tales como hormonas, enzimas, interferones, etc. (Tabla 4.3).

• En la identificación de antígenos presentes en las membranas celulares, tales como las moléculas CD3, CD4, CD8 y otras muchas. Esto ha permitido no sólamente la cuantificación de subpoblaciones celulares, sino también su fraccionamiento y aislamiento. En este sentido cabe destacar el empleo de equipos conocidos como clasificadores de células activados por fluorescencia" (FACS, Fluorescence Activated Cell Sorter)

• En trasplantes de órganos y enfermedades autoinmunes en donde los AcMo dirigidos contra los linfocitos T se utilizan frecuentemente  en casos de amenaza de rechazo agudo.

• En oncología para la localización de células tumorales  y/o su destrucción. Para ello los anticuerpos específicos frente a antígenos tumorales tales como el antígeno carcinoembrionario pueden ser marcados con sustancias radioactivas, como por ejemplo In¹¹¹ o Tc⁹⁹, y así localizar su situación en el organismo mediante una gammacamara especial cuando son  administrados a individuos afectos de tumores. También los AcMo pueden ser utilizados en la destrucción de células tumorales en oncología, para lo cual los anticuerpos son marcados con drogas citostáticas y citotóxicas. 

En esta panorámica general de la utilización de los anticuerpos monoclonales, asistimos hoy a una impresionante dispersión hacia otros muchos campos, lo cual permite vislumbrar esperanzadores horizontes a partir de una técnica que en principio surgió simplemente de la pretensión de desvelar la organización y expresión genética de las inmunologlobulinas, lo que acabo constituyendo un verdadero hito en la historia de la medicina y las ciencias biológicas.

Así pues, paulatinamente, los anticuerpos monoclonales van sustituyendo a los antisueros convencionales en base a las ventajas que su uso conlleva y en tanto que pueden producirse industrialmente.  Se expone un esquema del procedimiento seguido para la producción de AcMo para su posterior utilización tanto en el laboratorio como en la clínica como medio terapéutico y diagnostico (Figura 4.13).

Sin embargo, sería deseable que, para su aplicación terapeútica, los anticuerpos procedieran de linfocitos humanos y no de ratón o rata. Contrariamente a lo que se esperaba en un comienzo, la utilización de linfocitos humanos ha resultado difícil, en tanto que los intentos de inmortalizar hibridomas humanos mediante su fusión con células mielómicas de ratón o rata, han sido, hasta la fecha, decepcionantes. El problema reside en que, cuando se fusionan células humanas con células animales, hay una rápida pérdida preferencial de los cromososmas humanos en las células híbridas interespecies resultantes. En la actualidad se comienza a producir AcMo humanos empleando linfocitos B a los que se transforma en tumorales mediante su infección con el virus de Ebstein Barr, obteniéndose así linfocitos B productores de AcMo que pueden ser clonados y, por consiguiente, anticuerpos monoclonales homogéneos en su composición y especificidad.

AcMo quiméricos humanizados.

Como se ha comentado con anterioridad, uno de los problemas del uso de AcMo en medicina es que al ser en su mayoría de origen murino, cuando son administrados a individuos, éstos  producen anticuerpos frente a los mismos que disminuyen su eficacia o bien pueden presentar problemas de tipo alérgico cuando se usan reiteradamente.

Para evitar este problema  se estan ya obteniendo mediante técnicas de ingeniería genética anticuerpos humanizados de tipo quimérico. Estos anticuerpos se preparan mediante la creación de una molécula híbrida en la que se mantienen las partes del anticuerpo monoclonal de ratón que le confieren la especificidad (regiones V, D y J), y sustituir la región constante del anticuerpo de ratón por una región igualmente constante del mismo isotipo pero de procedencia humana. Para ello, es necesario disponer previamente del cDNA que codifica la inmunoglobulina de ratón de nuestro interés. Las regiones del DNA de ratón que contienen la especificidad del anticuerpo han de ser unidos a otro cDNA de humano que codifica para la región constante de una inmunoglobulina del mismo isotipo. Una vez que se han ligado las diferentes regiones de DNA de ratón y humano, esta construcción ha de ser subclonada en un vector apropiado y transfectada a una célula B a fin de que ésta produzca el anticuerpo humanizado, y que este posea una adecuada glicosilación. De acuerdo con esto, es posible eliminar de un anticuerpo de ratón (al menos parcialmente) sus regiones más inmunógenas, de manera que no sea reconocido como extraño por la persona que es inyectada el organismo humano (Figura 4.14).

Un paso más adelante en la humanización de los anticuerpos monoclonales producidos en ratón ha sido ya dado mediante la realización de los llamados anticuerpos hiperquiméricos. En este caso se rediseña la parte variable del anticuerpo, de manera que los aminoácidos correspondientes a la secuencia del anticuerpo de ratón que codifican las partes hipervariables para el sitio de unión se introducen en el contructor que codificará la parte variable dentro del marco de la región variable de un anticuerpo humano. Es decir, el anticuerpo humano va a servir únicamente como vehículo o vector de las regiones de determinantes complementarios (CDR) murinas, que son en realidad las responsables de la unión específica del anticuerpo con el antígeno.

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                 Capitulo de Inmunología-online coordinado por  J. Peña